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掃描電鏡生物樣品常用制備方法

 更新時(shí)間:2019-11-01 點(diǎn)擊量:6464

掃描電鏡在觀察生物樣品時(shí),具有以下特點(diǎn):多角度觀察樣品的表面結(jié)構(gòu);不需要將樣品切成薄片;景深大、圖像立體感強(qiáng);放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬倍連續(xù)可調(diào);在觀察形貌的同時(shí)可以對(duì)微區(qū)的成分進(jìn)行定量和定性分析。而能否獲得真實(shí)、清晰、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果,樣品的制備過程是關(guān)鍵。

 

生物樣品含水直接觀察,會(huì)對(duì)掃描電鏡造成以下影響:

 

1. 樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束,會(huì)被電離而放電,引起束流大幅度波動(dòng),使圖像模糊,或者根本不能成像;
2. 大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷,表面皺縮、變形;
3. 樣品揮發(fā)會(huì)造成鏡頭、光闌等的污染;
4. 燈絲會(huì)被上升水蒸氣氧化而變質(zhì)。

 

生物樣品的含水量高,二次電子產(chǎn)率低,導(dǎo)電性差,對(duì)熱,電子束敏感,僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察,絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金觀察。

 

干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),如果處理不好,會(huì)直接影響到觀察的清晰度與準(zhǔn)確度。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品,需要在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變,且必須確保干燥*。大多數(shù)動(dòng)植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此,需要針對(duì)不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法。

 

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

 

1. 自然干燥法

 

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā),或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。

 

對(duì)干種子、果殼、某些干花粉、昆蟲標(biāo)本等來說,自然干燥法是一個(gè)簡(jiǎn)易實(shí)用有效的方法,雖然在自然干燥過程中,樣品體積有所收縮,但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅(jiān)硬的樣品,如外表有殼的昆蟲,木材等。

 

   

自然風(fēng)干——飛納電鏡直接觀察螨蟲

 

2. 烘干干燥法

 

烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干,一般溫度控制在 80℃ 以下,烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快,但水分蒸發(fā)時(shí)可能造成樣品變形或斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品,比如淀粉粒、孢子粉等。

 

   

烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察

 

3. 臨界點(diǎn)干燥法

 

臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下,液體和氣體的密度相等,氣液界面*消失,液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點(diǎn)干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學(xué)掃描樣品可靠的干燥方法,是因?yàn)榇朔芟后w表面張力的作用,干燥出的樣品能zui大程度地保存其自然形態(tài)。

 

4. 冷凍干燥法

 

冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍,或使用溶劑將樣品中的水逐級(jí)替換后冷凍,然后抽真空升華。它是利用低溫和真空,使樣品中的水分或溶劑直接升華,以達(dá)到干燥樣品的目的。冷凍干燥過程不經(jīng)過液相階段,因而避免了氣相和液相之間表面張力對(duì)樣品的損傷。

 

5. 真空干燥法

 

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水(多用梯度脫水)的樣品置于真空容器中進(jìn)行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點(diǎn)的有機(jī)溶劑(叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等)作升華介質(zhì),既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點(diǎn),又不用對(duì)樣品進(jìn)行冷凍處理,無冷凍損傷,且操作簡(jiǎn)單。適用于所有生物樣品,特別是細(xì)菌、細(xì)胞等微小樣品。

 

    

經(jīng)過梯度脫水真空干燥的桿菌可以輕松獲得高倍圖像

 

小結(jié)

 

干燥方法在不斷改進(jìn),但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。上述 5 種干燥方法各有優(yōu)缺點(diǎn),且各有適用的生物樣品種類。我們?cè)谶x擇生物樣品干燥的方法時(shí),盡量選擇能保持樣品表面真實(shí)結(jié)構(gòu)的方法,在保證掃描電鏡狀態(tài)下,盡量還原樣品表面細(xì)節(jié)。

 

對(duì)于生物樣品,飛納電鏡低真空模式可以直接觀察一些生物樣品,如新鮮植物葉片,昆蟲等。觀察葉子氣孔,高亮度的 CeB6 燈絲可以在低曝光時(shí)間下快速拍照,獲得高質(zhì)量圖像,避免了長(zhǎng)時(shí)間曝光導(dǎo)致氣孔關(guān)閉以及長(zhǎng)時(shí)間抽真空導(dǎo)致葉片失水收縮。

 

   

飛納電鏡低真空下觀察葉子氣孔

 

此外,飛納電鏡的控溫樣品杯可以控制樣品溫度,進(jìn)而改變樣品周圍的濕度,大限度地降低電子束和真空度對(duì)樣品的損壞。適用于一些含水較高的水凝膠,蛋白,藻類等樣品,在冷凍狀態(tài)下,不脫水,背散射直接觀察,可以保持樣品的原始形貌結(jié)構(gòu)。

 

    

冷凍的水凝膠,觀察到其大范圍內(nèi),短程有序,長(zhǎng)程無序

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